对于一些色谱学家来说，他们第一次意识到高效液相色谱（HPLC）将成为一项重大突破是在1969年。那一年，他们前往拉斯维加斯，参加了由休斯敦大学化学家阿尔伯特·兹拉特基斯（Albert Zlatkis）组织的一系列会议中的第五次会议。

       此前的“色谱进展”系列会议主要聚焦于气相色谱，该技术通过将混合物中的挥发性化合物随着气体流经充满气体的色谱柱而实现分离。因此，1969年那次会议的许多与会者都是气相色谱专家，对将来被称为HPLC的这一技术所知甚少。他们迎来了色谱行业的一个划时代的觉醒。

       参会的罗纳德·马乔斯（Ronald Majors）回忆道：“那次会议在真正启动HPLC方面具有关键性意义。”在了解了这一尚处于初期阶段的技术后，“大家都非常兴奋。”

       当时，气相色谱仍然是主流的分离技术，但它也存在不足。最重要的是，气相色谱要求化合物必须是挥发性的，或者必须经过衍生化处理使其变得挥发。马乔斯说道：“但衍生化处理实在太麻烦了。”因此，许多大分子或极性分子无法通过气相色谱进行分析。

       而高效液相色谱则可以解决这个问题。在HPLC中，液体流动相将混合物带过充填有颗粒的色谱柱，当泵将流动相推过色谱柱时，化合物会与固定相（即颗粒的表面）发生不同程度的相互作用，从而实现分离。

       在那次命运般的拉斯维加斯会议上，HPLC引起了科学家的广泛关注，因为在诸如药物发现和生物分离等应用领域中，传统的分离方法（如气相色谱）根本无法满足需求。从那时起，HPLC已成为分析化学实验室中的主力工具，而从手性分离到蛋白质组学等各类应用，至今仍在推动HPLC技术不断进步。

       然而，在1969年时，HPLC还是相对鲜为人知的技术。时任联合石油公司科学家的劳埃德·斯奈德(Lloyd Snyder)回忆说，兹拉特基斯组织的那次会议成为了HPLC的转折点。但更让他印象深刻的是回家后发生的事情。他与其他参会者一起，在加州州立大学富勒顿分校组织了一次半天的会议，向那些未能参会的人介绍这一新技术。斯奈德说道：“我们原本预计可能只有15到20人出席。我们公告了这次会议，并安排在一间普通教室进行，但随着响应越来越多，会议地点逐渐换到更大的房间，最终在礼堂举行。大约有150人参加，我能看出这真是个热门话题。”

       据一些统计，HPLC的诞生是以耶鲁大学的Csaba Horváth和Seymour（Sandy）Lipsky在1966年发表了一篇关于有机化合物离子交换分离的论文（Nature 1966, DOI: 10.1038/211748a0）为标志的。一年后，他们又发表了一篇关于快速液相色谱的论文，在那篇论文中，他们使用的泵的工作压力比之前更高（Anal. Chem. 1967, DOI: 10.1021/ac60256a003）。他们是那次具有里程碑意义的拉斯维加斯会议上的先驱之一，将这一技术介绍给了色谱界其他成员，这项技术后来便被称为HPLC。

       当时，柯克兰在杜邦工作。他曾在几年前尝试使用液相色谱，但那时现有的设备和知识水平尚不足以胜任这一任务。与胡伯的会面激励他再次尝试。回国后，柯克兰说服杜邦管理层让他从事HPLC的研究。他表示：“我的工作主要集中在农药领域，我们有许多化合物并不适合用气相色谱分析。液相色谱一直是我重点关注的技术。”

       即使在HPLC出现之前，色谱学家们也已经在使用液—液色谱。该方法中，第一个“液体”指的是流动相，第二个“液体”指的是涂覆在填料上的液体，而这两种液体必须是不互溶的。柯克兰指出，要使这项技术发挥作用，必须确保涂层与流动相的比例恰到好处，以防流动相将涂层冲走。他补充道：“这种操作虽较为困难，但却是一种非常强大的技术。”

       当胡伯和柯克兰致力于各自仪器的研发时，Horváth正专注于研发一台用于分离生物分子的仪器，实际上他称之为核酸分析仪。同时，色谱仪器公司沃特斯协会（现称沃特斯公司）正努力推出第一台商用HPLC仪器——无论你如何界定仪器的标准，这一领域的探索甚至早于胡伯的版本。

       然而，要确定HPLC的确切诞生日并不容易，因为早在将其付诸实践之前，这一理念就已被预见。1941年，未来的诺贝尔奖得主阿彻·J·P·马丁（Archer J. P. Martin ）和理查德·L·M·辛格（Richard L. M. Synge ）撰文指出，对于一种称为液—液分配色谱的方法来说，色谱柱分离化合物的能力取决于流动相的流速以及填充在色谱柱内颗粒直径的平方。他们使用“理论塔板”这一概念来描述色谱柱分辨混合物的能力——理论塔板越薄，分离效果越好。他们写道：“最小的理论塔板应通过使用非常小的颗粒和在色谱柱全长上施加较大的压力差来获得。”（Biochem. J. 1941, DOI: 10.1042/bj0351369）

       因此，人们早在1941年就知道，要实现高效的液相色谱分离，就需要高压和小颗粒填充材料的结合。但从理论到实践却花了近30年的时间，因为许多问题需要解决。

       通常认为，Horváth制造了第一台HPLC仪器，他与Lipsky在《Nature》和《Analytical Chemistry》上发表的论文可能正是现代HPLC的首批公开报道。然而，如果你问色谱学家现代HPLC的起源，他们更可能提到1964年——那一年，约瑟夫·杰克·柯克兰（Joseph Jack Kirkland）访问了埃因霍温理工大学。“在我参观的一个实验室里，有个叫约瑟夫·F·K·胡伯（Josef F. K. Huber）的人，他在做我现在称之为HPLC的工作，”柯克兰回忆道，“他拥有一台非常简陋的仪器，带有紫外检测器，他填充了一根色谱柱，这些颗粒实际上是用于气相色谱的，但他在上面涂覆了液体。”

       20世纪60年代初，沃特斯从陶氏化学获得了凝胶渗透色谱的技术许可，该方法通过将大分子（如聚合物）根据分子大小的不同，通过充填交联聚合物微球的色谱柱来实现分离。沃特斯于1963年推出了GPC-100仪器，该仪器包含一台工作压力为500 psi的泵。关于这台GPC仪器是否应被视为第一台商用HPLC，还是仅仅是其前身，业内仍有争议。不久之后，该公司又推出了一台采用了从壳牌开发技术许可的液—液色谱仪器，但这台仪器并不成功。公司创始人詹姆斯·L·沃特斯（James L. Waters）回忆道：“那真是一场灾难。原本应固定在填料颗粒上的液体并不能始终附着在上面。我们制造了三台仪器，卖出了一台，但最后都被退回，这段尝试就此结束。”

       但沃特斯并没有放弃HPLC的仪器开发。该公司在这一领域的下一次尝试取得了可喜的成功。1967年推出的ALC-100仪器采用了比GPC系列更高压力的泵，并定位为通用分析仪器，广泛被认为是第一台成功的商用HPLC。

       HPLC市场在沃特斯赢得世界知名有机化学家、化学诺贝尔奖得主及哈佛大学教授罗伯特·B·伍德沃德（Robert B. Woodward）的认可后迅速打开。1972年的一个星期五，伍德沃德的博士后赫尔穆特·哈曼伯格（Helmut Hamberger）带着一个问题找到了沃特斯——他正试图分离维生素B-12合成过程中某中间体的异构体。当时，詹姆斯·沃特斯回忆说：“我当时并不知道伍德沃德是谁，他在哈佛只是一个普通的化学家。”但沃特斯的同事詹姆斯·利特尔（James Little）了解情况，他曾对沃特斯说：“如果我们能为他解决这个问题，就能卖出很多仪器。”

       沃特斯一直认为，有机合成可能成为HPLC的主要市场，因此他亲自将ALC-100带到伍德沃德的实验室。“到了第二天结束时，我基本上解决了这个问题，并为他分离出了少量物质，”他说。为分离更多样品，他不断增加注入量，并将输出物循环回色谱柱中，“我大约需要循环七次，才能将其他异构体分离开，从而得到伍德沃德所需的那一种。

      “沃特斯将这一成功转化为新的市场机遇。他利用美国化学会的研究生名录整理出一份有机化学家的名单，并向每位化学家邮寄了一份包含伍德沃德照片和他们成果描述的宣传册。接下来的一年里，沃特斯表示：“我们大概卖出了40台仪器，从那以后，由于我们的声誉和经验，我们牢牢占据了有机合成市场。”