大家在异构体方法开发时，是不是经常会碰这种情况：缓梯度和等度的分离效果优于梯度，但有机相比例稍高时，异构体间不能完全分离；降低有机相比例到一定程度后，分离度就无法再有提高，甚至异构体间看着已完全分离，但因为峰过宽导致积分后分离度不符合要求。无法通过调整有机相的比例来达到峰形与分离度的兼顾，这种情况下，我们真的没办法了吗？

今天通过两个案例来给大家介绍一个小妙招来解决这个问题。

待分离组分部分结构式

实验一

色谱条件

下一步思路

各峰分离度不佳，峰堆在一起，继续放缓梯度。

下一步思路

主峰与前后杂质分离度分别为：1.55和1.79，在此基础上继续放缓梯度，发现没有改善。这种情况下，我们通过在梯度前加一段20分钟40%有机相的等度段，使样品在色谱柱内，以一个较缓慢的速度来加大各组分间的分离，再通过梯度的方式使各组分洗脱。

结论：主峰与前后杂质分离度分别为：1.75和1.84。

可见，这种情况下，我们通过在梯度前加一段低比例有机相段（此例中为前20分钟的这一段），使样品在色谱柱内，以一个较缓慢的速度移动，来加大各组分间的分离，再通过梯度的方式使各组分洗脱。这种方式，可以起到一个比较好的增加分离的效果。

左羟丙哌嗪结构式

方法开发过程中发现，在月旭Utimate Cellu-JR（4.6×250mm，5μm）色谱柱上，两个峰一直有一定的分离趋势，等度条件下分离度优于梯度，但随着有机相比例的下降，两个峰始终无法完全分离，而且随着有机相比例降低，峰形也在变差。

实验一

色谱条件

下一步思路

两峰分离度为1.4。

在这个基础上，在前20分钟的70%甲醇比例的等度，使两个手性异构体在色谱柱内以较缓慢的速度移动以加大分离。再用5分钟梯度回到85%甲醇来加快洗脱以修正峰形。

结论：两成分的分离度1.9。

可见，这种情况下，我们通过在梯度前加一段低比例有机相段（此例中为前20分钟的这一段），使两个手性异构体在色谱柱内以较缓慢的速度移动以加大分离。再用5分钟梯度回到80%甲醇来加快洗脱以修正峰形。这种方式，可以起到一个比较好的增加分离的效果。