极性化合物分析一直是分析领域面临的难题，常见难点主要表现为样品保留弱，从而无法进行后续的定性与定量分析。近年来，极性化合物分离分析的需求也越来越多，比如极性药物的分析，有机酸、核苷酸，生物碱等。如何选择合适的分离模式和色谱柱困扰着大多数的实验室分析人员。
本期将为大家带来极性化合物方法开发策略，包括：
常见的分离模式有哪些？
不同分离模式有哪些注意事项？
色谱柱如何进行选择？
1. 分离模式的选择及注意事项
1）常规反相
• 方法比较熟悉；
• 稳定性强，色谱柱可选择种类多；
• 极性化合物保留不强，常规C18在纯水相中易“疏水塌陷”，需选择耐纯水色谱柱。
2）离子对反相
• 流动相中添加离子对试剂，提高离子型化合物的保留和峰形，通用性强；
• 柱平衡时间久；
• 离子对试剂将色谱柱改性，降低色谱柱使用寿命；
• 离子对试剂不挥发，抑制离子化效率，不兼容MS。
3）混合模式
• 具有两种以上保留机理；
• 流动相无需使用离子对试剂即可分离强极性化合物；
• 方法不熟悉，开发时有挑战。
4）离子交换色谱
• 保留可离子化的化合物；
• 使用高浓度的缓冲盐或pH梯度来洗脱，应用于质谱时受限。
5）亲水相互作用（HILIC）模式
• 互补反相的一种分离模式；
• 化合物极性越强保留越强；
• 高有机相体系，有利于提高MS的灵敏度；
• 越来越常见，开始得到广泛应用；
• 色谱柱、方法稳定性不如反相色谱，平时更需注重操作细节。
2. 色谱柱的选择
针对极性化合物分析，月旭科技拥有丰富的色谱柱类型供大家选择：
1）耐纯水的色谱柱
适用于高比例的水相或100%水相流动相体系，提高极性化合物保留。
• 极性基团封尾 Ultimate® AQ-C18
• 极性基团嵌入 Ultimate® Polar RP/ Ultimate® Alk C18
• 不封端工艺 Ultimate® LP-C18
2）离子交换色谱柱
通过改变流动相pH、离子强度和有机改性剂含量，以增加离子化、大极性样品的保留。
• 阴离子交换柱 Ultimate® XB-SAX
• 阳离子交换柱 Ultimate® XB-SCX
3）HILIC色谱柱
固定相为极性（裸硅胶、酰胺、氨基等），故可轻易吸附水和其他极性溶剂，适用于保留极性和亲水化合物。
• 裸硅胶 Ultimate® HILIC Silica
• 氨基键合相 Ultimate® HILIC- NH2
• 酰胺基键合相 Ultimate® HILIC Amide
• 两性离子键合相 Ultimate® HILIC Amphion Ⅱ
4）专用色谱柱
• 草甘膦检测专用柱 Blossmate® SAX
• 盐酸二甲双胍专用柱 Xtimate® XB-SCX
3. 极性样品保留思路及应用案例分享
常规反相
对于极性化合物的分析，我们最容易想到的是通过增加流动相中水相的比例以减弱洗脱强度，从而增加极性化合物的保留。一般来说，分析物的极性越大，流动相中水的比例也需要更高。此时可以选择耐纯水分析的色谱柱，以达到更加稳定的效果。
配方颗粒来源于中药饮片的水提物，可检出组分（如核苷、有机酸等）极性较强。此时可以从大比例或100%的水相开始进行梯度淋洗。
应用案例1：板蓝根颗粒含量测定
参考标准：中国药典2020版一部
色谱柱：Ultimate® AQ-C18（4.6×250mm，5μm)
流动相：A：水；B：甲醇
柱温：30℃
检测波长：254nm
流速：0.8mL/min
进样量：5μL
梯度洗脱：
离子对反相
当您用100%的水或缓冲盐流动相，仍得不到足够的保留时，离子对方法或许是个好的选择。
对于酸性化合物，常用的有四丁基氢氧化铵， 四丁基溴化铵等；
对于碱性化合物，常用的有辛烷磺酸钠等各种烷基磺酸盐；
另外，三氟乙酸，七氟丁酸等全氟取代的直链有机酸既可作为离子对试剂，也可调节流动相pH，也常被添加到流动相中。
维生素作为六大营养物质之一，在人体内发挥着重要的作用。根据它们的溶解特性，这些维生素可分为脂溶性维生素和水溶性维生素。使用HPLC分离维生素时，因化合物极性大，可以添加离子对试剂来增强目标物保留。
应用案例2：维生素B6含量测定
参考标准：中国药典2020版二部
色谱柱：Ultimate® XB-C18（4.6×250mm，5μm)
流动相：0.04%戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节 pH值至3.0）/甲醇=85/15
柱温：35℃
检测波长：291nm
流速：1.0mL/min
进样量：10μL
HILIC模式
此外，为了改善大极性物质的保留，还可以改变分离模式。HILIC模式是亲水性相互作用模式，综合了液液分配、离子交换和氢键作用力，通过极性间作用力来改变分离选择性，增强大极性物质的保留。
应用案例3：枸杞中甜菜碱含量测定
甜菜碱是一种化学结构与氨基酸相似的生物碱，广泛存在于枸杞、甜菜和豆科植物中。在20℃条件下其LogP值为-3.1，是一种高极性化合物。在常规反相上保留较弱，此时可以使用HILIC模式进行分析。
参考标准：中国药典2020版一部
色谱柱：Ultimate® HILIC-NH2（4.6×250mm，5μm)
流动相：乙腈/水=85/15
柱温：30℃
检测波长：195nm
流速：1.0mL/min
进样量：5μL
应用案例4：麦角硫因测定
麦角硫因是一种天然的抗氧化剂，在人体内可以对细胞起到保护作用，是机体内的重要活性物质。因其安全、无毒，在医药、食品、化妆品及生物技术等领域具有广泛的用途和市场前景。
从结构中可以看出，麦角硫因的极性较强，且同时带有正负电荷，此时可以采用HILIC Amphion Ⅱ两性离子色谱柱实现样品保留。
液相色谱条件
色谱柱：Ultimate® HILIC Amphion Ⅱ（4.6×250mm，5μm)
流动相：乙腈/水=78/22
检测波长：254nm
柱温：30℃
流速：1.0mL/min
进样量：20μL
专用柱
应用案例5：草甘膦原料测定
长久以来，以草甘膦为代表的极性农药分析一直都是检测难点，传统反相C18色谱柱上存在着保留弱、分离难、重复性差等问题，月旭科技的草甘膦检测专用柱可有效解决此类问题，目标峰保留在5min左右。
液相色谱条件
色谱柱：Blossmate® SAX（4.6×250mm，5μm)
流动相：100mM KH2PO4/CH3OH=85/15(pH调节为2.0)
检测波长：195nm
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
进样量：20μL
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